CardioNGS

Ανάπτυξη Γενετικής Διάγνωσης Καρδιαγγεικών Παθήσεων με ειδικά Γονιδιακά πάνελ και Next Generation Sequencing (κωδικός έργου Τ1ΕΔΚ 03)

Η πρωταρχική αιτία θανάτου και νοσηρότητας παγκοσμίως είναι οι καρδιοαγγειακές παθήσεις (CVDs), κυριότερες κατηγορίες των οποίων είναι οι μυοκαρδιοπάθειες, οι καρδιακές αρρυθμίες (καναλοπάθειες κλπ.) και οι παθήσεις βαλβίδων (βαλβιδοπάθειες) και διαφόρων αγγείων και κυρίως της αορτής (αορτικό ανεύρυσμα, σύνδρομο Marfan κ.α.). Οι μυοκαρδιοπάθειες διακρίνονται σε διατατική (DCM), υπερτροφική (HCM), περιοριστική (RCM) και αρρυθμιογόνο δεξιάς κοιλίας (ARVC). Συνηθέστερο αποτέλεσμα τους είναι η καρδιακή ανεπάρκεια, ενώ σε αρκετές περιπτώσεις παρατηρείται αιφνίδιος καρδιακός θάνατος (SCD), χωρίς προηγούμενα συμπτώματα και οφείλονται σε μεγάλο ποσοστό σε γενετικούς παράγοντες. H HCM από μόνη της θεωρείται υπεύθυνη για το 50% περίπου των περιπτώσεων SCD σε νέους κάτω των 30 ετών και αθλητές. Στην Ελλάδα υπολογίζεται ότι περίπου 20.000 νέοι κάτω των 30 βρίσκονται σε κίνδυνο αιφνίδιου καρδιακού θανάτου.

Όπως οι καρδιοαγγειακές έτσι και οι νευρομυϊκές παθήσεις είναι σύνθετα πολυπαραγοντικά νοσήματα και ο γενετικός έλεγχος τους έχει τεράστια σημασία για α) τη γενετική διάγνωση και επιβεβαίωση μιας κλινικής διάγνωσης, β) τη διάκριση κληρονομικών και μη κληρονομικών μορφών της νόσου, προς ενημέρωση των συγγενών, γ) την πρόγνωση και αξιολόγηση κινδύνου ασυμπτωματικών συγγενών ενός ασθενούς και δ) την έγκαιρη διάγνωση και πρόληψη του αιφνίδιου καρδιακού θανάτου σε νέους και αθλητές κ.α.

Oι μυοκαρδιοπάθειες θεωρούνται στην πλειοψηφία τους κληρονομούμενες διαταραχές του μυοκαρδίου που οφείλονται σε μεταλλαγές σε γονίδια πρωτεϊνών του κυτταρικού σκελετού του μυοκαρδιοκυττάρων (desmin, lamin Α/C, titin κ.α., κυρίως σε DCM), των εμβόλιμων δίσκων (δεσμοπλακίνη, δεσμοκολίνη κ.α., κυρίως σε ARVC), του σαρκομεριδίου (myosins, troponin, tropomyosin κ.α., κυρίως σε HCM) και της ομοιόστασης του Ca+2. Συνολικά, πληθώρα μεταλλαγών, σε περισσότερα από 90 γονίδια, έχουν βρεθεί να συνδέονται με μυοκαρδιοπάθειες, και περίπου 80 γονίδια με καναλοπάθειες και βαλβιδοπάθειες/αγγειοπάθειες. Μεταλλαγές σε μεγάλο ποσοστό των ανωτέρω γονιδίων οδηγούν επίσης σε διάφορες μυοπάθειες/μυϊκές δυστροφίες (MD), όπως Duchenne MD, Becker MD, Emery-Dreifus MD, Nemaline MD, Limb-Girdle MD, myofibrillar myopathy κλπ., με τα γνωστά δραματικά επακόλουθα. Παγκοσμίως το 14% των μυοπαθειών είναι κληρονομούμενες.

Ο στόχος της προσπάθειας μας ήταν η ανάπτυξη, η επικύρωση και η τυποποίηση σε
ένα τελικό προϊόν, της πλέον περιεκτικής, αναλυτικής και ευαίσθητης μεθόδου γενετικής
διάγνωσης και πρόγνωσης καρδιαγγειακών και νευρομυϊκών νόσων, με targeted Next Generation sequencing.

Για το σκοπό αυτό χτίσαμε μια περιεκτική λίστα γονιδίων, μετά από διαδοχικές επικαιροποιήσεις με διαρκή και ενδελεχή έλεγχο της σχετικής βιβλιογραφίας, με σύγκριση με εμπορικά διαθέσιμα αντίστοιχα panel γονιδίων (Illumina TruSight Cardio gene panel, SOPHiA genetics Extended Cardio Solution κ.α.) και με διαρκή ενημέρωση από σχετικές βάσεις δεδομένων (Varsome, Clinvar, gnomAD, Genomics England PanelApp κ.α.).

Για αυτή τη λίστα των 415 συνολικά γονιδίων των οποίων οι μεταλλαγές συσχετίζονται με μυοκαρδιοπάθειες, καρδιαγγειακές νόσους και νευρομυϊκά σύνδρομα δοκιμάσαμε διαφορετικές τεχνολογίες target capture, λογισμικών panel probeset design και εμπορικά διαθέσιμων αντιδραστηρίων από διάφορες εταιρίες, αλλά και βελτιώσεων των εργαστηριακών πρωτοκόλλων και των βιοπληροφορικών pipelines.

Το τελικό μας προϊόν καλύπτει συνολικά 415 γονίδια, με μέγεθος 1.226.475 Mb, με κάλυψη >50Χ στο 99,91% των βάσεων, με το υπόλοιπο 0,89% που δεν καλύπτεται να αποτελείται αποκλειστικά από repetitive elements, περιοχές πολύ δύσκολο να αλληλουχηθούν με τις υπάρχουσες τεχνολογίες.

Με το τελικό αυτό panel συνολικά αναλύθηκαν 285 διαφορετικά δείγματα, αρκετά εκ των οποίων περισσότερες από μια φορές στα πλαίσια των δοκιμών μας για τις διαρκείς βελτιώσεις των εργαστηριακών διαδικασιών και των αλγορίθμων σχεδιασμού του panel. Τα δείγματα αυτά περιλαμβάνουν τόσο DNA που απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα, αλλά  και DNA που απομονώθηκαν από καρδιακό ιστό ασθενών που είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε μεταμόσχευση καρδιάς. Συνολικά από τις αναλύσεις των δειγμάτων έχουμε εντοπίσει 118 παθογόνες ή/και πιθανά παθογόνες παραλλαγές πολλών διαφορετικών τύπων και μηχανισμών δράσης, σε συνολικά 70 διαφορετικά γονίδια. (Εικόνες 1 & 2)

Το τελικό προϊόν (CVD NGS panel) θα χρησιμοποιείται για την πληρέστερη γενετική διάγνωση καρδιαγγειακών και νευρομυϊκών παθήσεων και συνεπώς για την πληρέστερη γενετική καθοδήγηση ασθενών ή/και υγιών ατόμων (αθλητών)

Για το προϊόν μας έχουμε προχωρήσει και τις διαδικασίες κατοχύρωσης «Διπλώματος Ευρεσιτεχνίας/Πατέντα» από τον Οργανισμό Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας (Ο.Β.Ι.) με τίτλο « Ευρεία και ισχυρή Γενετική Διάγνωση Καρδιαγγειακών και Νευρομυϊκών Παθήσεων με αλληλούχιση νέας γενεάς”, με εσωτερικό αριθμό πρωτοκόλλου ΑΠ 05/29-04—2023 του γραφείου Μεταφοράς Τεχνολογίας του ΙΙΒΕΑΑ

Εικόνα 1. Το σύνολο των παθογόνων/πιθανά παθογόνων παραλλαγών που εντοπίστηκαν στα δείγματα μας στις έως τώρα αναλύσεις

Εικόνα 2. Α. Οι διαφορετικοί τύποι των παραλλαγών που εντοπίστηκαν. Β. Οι διαφορετικοί μηχανισμοί των παραλλαγών.