Ερευνα

Οι επαγόμενες από φωσφορυλίωση δια-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις κατά τη διάρκεια της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης των υποδοχέων κινασών τυροσίνης (RTK) και των υποδοχέων συζευγμένων με πρωτεΐνη G (GPCRs), προκαλούν μη αντιστρεπτή επαγωγή μονοπατιών κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σε μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια,  τα μονοπάτια χαρακτηρίζονται για την πολυπλοκότητα και την ικανότητα τους να αλληλοεπιδρούν ως συνέπεια σημάτων ανατροφοδότησης από το κυτταρικό περιβάλλον προκειμένου να διατελέσουν περίπλοκες λειτουργίες. 

Η βασική μας υπόθεση είναι πως οι αλλαγές αυτές καθίστανται εφικτές χάρη στην πληθώρα των πρωτεϊνών και στις αλλαγές στη στοιχειομετρία τους, οι οποίες οφείλονται στην έκφραση αναπτυξιακά ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών που στη συνέχεια οδηγούν σε διαφορική ρύθμιση μεταγραφικών/μεταφραστικών προγραμμάτων και μετα-μεταφραστική τροποποίηση πρωτεϊνών.
Εστιάζοντας στο κύριο μονοπάτι των νευρικών κυττάρων PKC/NF1/Ras/Raf/MEK/ERK,  μελετάμε το δίπολο της PKC-ε και της νευροινιδίνης RasGAP, μιας πρωτεϊνικής κινάσης και του ειδικού της υποστρώματος (προηγούμενη εργασία μας), ως διακόπτες ενεργοποίησης μονοπατιών, αποκρινόμενοι στο βιολογικό αποτέλεσμα  των υποδοχέων.

Ρόλος του PKC/Neurofibromin/Ras/Raf/MEK/ERK μονοπατιού στην εξέλιξη και στην ασθένεια

Η ενδελεχής μας διερεύνηση της σηματοδότησης του υποδοχέα κανναβινοειδών στους νευρώνες ανέδειξε τόσο νέους άμεσους σηματοδοτικούς στόχους, όσο και την σημασία του ρόλου της νευροϊνιδίνης ως RasGAP σε αυτό το μονοπάτι. Ειδικότερα αναγνωρίσαμε τις κινάσες PKCε και Src, ως άμεσους τελεστές, εμπλεκόμενους στην ενεργοποιήση της ERK, φυσικά συζευγμένους με  τον υποδοχέα CB1. Οι κινάσες αυτές, μετά από διαμοριακές φωσφορυλιώσεις, δημιουργούν ένα βρόγχο σηματοδοτικής ενίσχυσης μέσω ενεργοποίησης του FGF υποδοχέα. Επιπλέον, τεκμηριώσαμε τον ρόλο των μεμβρανικών σχεδιών (lipid rafts) ως πλατφόρμες όπου λαμβάνει χώρα η σηματοδότηση του CB1 υποδοχέα προς την ERK για μια πληθώρα διεργασιών από την νευρωνική διαφοροποίηση και την ενεργοποίηση της μικρογλοίας, μέχρι πιο σύνθετες συμπεριφορές όπως η μνήμη και η όρεξη. Οι λιπιδικές σχεδίες λειτουργούν ρυθμιστικά στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση καθώς οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε αυτή έχουν την τάση να συσσωρεύονται στην διεπιφάνεια λιπιδικών σχεδιών-κυτταροπλάσματος.

Χρησιμοποιώντας το παράδειγμα ενός CB1 αγωνιστή, μελετήσαμε τον τρόπο με τον οποίο η νευροϊνιδίνη αλληλεπιδρά με τη κυτταρική μεμβράνη, προκειμένου να δράσει ως RasGAP. Έχουμε αποδείξει πως η ενεργοποίηση της PKCε προηγείται της ενεργοποίησης Ras, ενώ η ενεργοποιημένη PKCε, που επίσης στρατολογείται άμεσα στις λιπιδικές σχεδίες, οδηγεί σε έναν παροδικό και ειδικό εμπλουτισμό της πρωτεΐνης  SOS1 στα διατεταγμένα λιπιδικά κλάσματα. Η πλευρική μετακίνηση σε λιγότερο διατεταγμένες περιοχές του ενεργοποιημένου H-Ras εντοπίζεται μέσω ανοσοαποτυπώματος Western, ωστόσο σύντομα το H-Ras επανεμφανίζεται στα διατεταγμένα κλάσματα, λόγω της δράσης της νευροϊνιδίνης RasGAP που επίσης συνδέεται έντονα με τις λιπιδικές σχεδίες. Αυτή η κινητικότητα (treadmilling) επιβεβαιώνει ότι η νευροϊνιδίνη φιλτράρει την πληθώρα των μορίων H-Ras που ενεργοποιούνται από το SOS1, ελέγχοντας έτσι την περαιτέρω μεταγωγή του σήματος στα κύτταρα.

Ιδιαίτερα σημαντική κατέστη η πειραματική επιβεβαίωση της σημασίας των βιομοριακών συμπυκνωμάτων, δηλαδή της τοπικής αύξησης της συγκέντρωσης μακρομορίων σε περιοχές του κυττάρου που δεν περιβάλλονται από κάποια μεμβράνη, στο βιολογικό αποτέλεσμα της σηματοδότησης υποδοχέων.

Η Νευροϊνιδίνη αποτελεί προϊόν έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου NF1, μεταλλαγές του οποίου είναι υπεύθυνες για την ανάπτυξη Νευροϊνωμάτωσης τύπου Ι (NF-1). Τα συμπτώματα της NF-1 καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα,  που κυμαίνεται από αυτισμό μέχρι προδιάθεση για καρκίνο γλοιοβλαστώματος. Μέχρι στιγμής, έχουν εντοπιστεί περισσότερες από 3000 μεταλλάξεις στο γονίδιο NF1 χωρίς όμως να υπάρχει συσχέτιση μεταξύ γονότυπου και φαινότυπου των ασθενών. Η πολυπλοκότητα της ασθένειας ενισχύεται λόγω των γεγονότων εναλλακτικού ματίσματος στο γονίδιο NF1 που εξαρτώνται από το στάδιο ανάπτυξης και τον κυτταρικό τύπο, με αποτέλεσμα την έκφραση διαφορετικών ισομορφών της πρωτεΐνης.

Με γνώμονα αυτό, αποσκοπούμε στο χαρακτηρίσμό του λειτουργικού ρόλου των επιμέρους πρωτεϊνικών περιοχών κάθε πιθανής ισομορφής. Παραδείγματος χάριν, ανακαλύψαμε ότι οι ειδικές φωσφορυλιώσεις στο Ν-τελικό άκρο (CSRD) ρυθμίζει αλλοστερικά την  παρακείμενη περιοχή GRD (υπεύθυνη για την RasGAP ενεργότητα της πρωτεΐνης), αλλάζοντας την επαγόμενη, από τον EGF υποδοχέα, διαφοροποίηση σε πολλαπλασιασμό. Το γεγονός αναγνωρίστηκε πρόσφατα από ομάδα γενετιστών ως η μόνη εξήγηση συσχέτισης γονότυπου-φαινοτύπου. Συγκεκριμένα, μεταλλάξεις μεμονωμένων αμινοξέων στο CSRD  χαρακτηρίστηκαν υπεύθυνες για την υψηλή πιθανότητα εμφάνισης κακοήθειας.

Το πιο σημαντικό πρόσφατο μας εύρημα αφορά τη λειτουργία της νευροϊνιδίνης ως πρωτεΐνη που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους (MAP). Έχοντας δείξει ότι μια PKC-ε-φωσφορυλίωση του αμινοξικού καταλοίπου, Ser2808, δίπλα σε ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) στην καρβοξυτελική περιοχή (CTD), οδηγεί κατά τρόπο εξαρτώμενο από το Ran, την νευροϊνιδίνη στον πυρήνα και στους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής ατράκτου (MTs), διαπιστώσαμε ότι η αποσιώπηση όλων των μεταγράφων και των ισομορφών αυτής της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης, με τη μεσολάβηση siRNA, οδηγεί σε παρεκκλισεις στην χρωμοσωμική σταθερότητα, αποκαλύπτοντας τη σημασία της νευροϊνιδίνης ως μιτωτικής MAP.

Στη συνέχεια, μελετήσαμε τις επιμέρους ιδιοτήτες των ισομορφών νευροϊνιδίνης NLS και ΔNLS, προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος του εξωνίου 51 που κωδικοποιεί 41 αμινοξέα και φέρει το σήμα πυρηνικού εντοπισμού, NLS.  Χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένες κυτταρικές σειρές, διαπιστώσαμε πως οι ισομορφές διαφοροποιούνται ως προς τη λειτουργία τους α. ρυθμίζοντας τη συχνότητα εντοπισμού σημείων τομής των κυτταροπλασματικών ΜΤ, επιδρώντας στην δημιουργία  πολυμερών β-τουμπουλίνης είτε στο κυτταρόπλασμα είτε στη μιτωτική άτρακτο, και συμβάλλοντας σε διαφορετικά μοτίβα μετανάστευσης των κυττάρων, και β. συμμετέχοντας ενεργά, πιθανώς ασκώντας αντίθετα αποτελέσματα, στο σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου και των μιτωτικών μικροσωληνίσκων, και στην αποτελεσματική, χωρίς σφάλματα χρωμοσωμική σταθερότηα και τον ακριβή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων.